Со времен второй части прошло несколько лет. Эцио уже не молодой парень, а мужчина сорока лет. Он и его дядюшка Марио возвращаются на виллу Монтериджонни. И вдруг рядом с Эцио разрывается ядро, но Марио успокаивает Эцио сказав, что на вилле проходят учения. Приехав домой Эцио встречается с Катериной Сфорца. После незабываемой ночи с Катериной, Эцио отдыхал на кровати, и вдруг ядро пробило крышу дома.

На виллу напали, это был Борджиа, которого Эцио пощадил в конце второй части игры. В бою погиб Марио, и яблоко Эдема попадает в руки Борджиа. Эцио раненый и обезсиленый вынужден бежать. Он отправляется за Борджиа в Рим. В Риме Эцио начал все с начала. Поднялся на вершины иерархии, завел новых друзей, обучил убийц, отремонтировал пару зданий. И вот Эцио узнает местонахождение Борджиа и отправляется туда. Убив врага Эцио завладевает яблоком Эдэма и потом прячет его. Узнав где яблоко, Дезмонд отправляется за ним, но его на месте ждет сюрприз.